Numero 5 – Maggio 2022 – Xenoscreen

XENOSCREEN E XENOSCREEN XL– Kits per la rilevazione degli estrogeni e degli androgeni umani nei vari campioni.

In questa pubblicazione valuteremo le prestazioni di 2 kit disponibili nel nostro catalogo per la rilevazione di composti estrogenici e androgeni. I kit “XenoScreen” e “XenoScreen XL”, basati su cellule di lievito trasfettate rispettivamente con i recettori umani degli estrogeni e degli androgeni (YES e YAS, Routledge e Sumpter, 1996).

I test vengono eseguiti in micropiastre e sono in grado di rilevare sia attività attivanti (agoniste) che inibitorie (antagoniste). Le attività ormonali delle sostanze in esame vengono rilevate utilizzando un costrutto del gene reporter lacZ (β-galattosidasi) e il substrato altamente sensibile CPRG che porta a un cambiamento di colore nel terreno dal giallo al viola.

Il kit XenoScreen si basa sul protocollo originale e utilizza un tempo di incubazione di 48 ore, mentre il kit XenoScreen XL si basa su un protocollo di esposizione modificato di 18 ore che utilizza l’enzima liticasi per facilitare il rilascio della β-galattosidasi dalle cellule di lievito .

Sono state valutate diverse sostanze chimiche con attività estrogeniche e androgene note che vanno da forti a deboli e composti di controllo negativi, tra cui 14 sostanze chimiche raccomandate nella linea guida OECD 455 “Linee guida per i test basati sulle prestazioni per saggi in vitro di transattivazione stabile per la rilevazione degli agonisti dei recettori degli estrogeni” per la verifica della capacità di laboratorio. Entrambe le versioni del kit sono state in grado di identificare correttamente queste sostanze chimiche.

Principio del test

Gli interferenti endocrini sono sostanze ormonalmente attive, sostanze chimiche esogene che possono interferire con il sistema endocrino del corpo.
Possono essere trovati in prodotti di uso quotidiano, e. g. g., cosmetici, cibo, bottiglie di plastica, lattine di metallo, detergenti, giocattoli, pesticidi, …

Recettore estrogeno umano (YES) e recettore androgeno (YAS) vengono integrati  nel cromosoma del comune lievito di birra (Saccharomyces cerevisiae).

Un plasmide, contenente il sistema genico reporter operone Lac Z codifica per la  β-galattosidasi sotto il controllo di elementi di risposta di estrogeni o androgeni, permette il saggio colorimetrico.

I composti ormonalmente attivi si legano al recettore e innescano questo sistema di gene reporter.

L’attività ormonale viene rilevata in un formato micropiastra attraverso la lettura colorimetrica in quanto il legame di un composto al recettore induce la sintesi della β-galattosidasi che converte il substrato giallo CPRG (chlorophenol red-β-D-galactopyranoside) in un metabolita rosso (clorofenolo) quantificato colorimetricamente a 570 nm.

Vantaggi

Completo: vengono rilevate quattro attività contemporaneamente: estrogeni e androgeni attivanti (agonisti) e inibitori (antagonisti)
Sensibile: attività rilevate fino al range picomolare (limite di rilevamento: 4 · 10 12 M)
Conveniente: formato micropiastra (sono necessari solo 16 μ l di campione) configurazione sperimentale flessibile
Efficiente: fino a 4 campioni (8 diluizioni in duplicato) entro 18 ore (1-2 ore manodopera)
Valore aggiunto: File Excel fornito per l’analisi dei dati (valutazione gratuita per i clienti)

Come funziona il kit

Primo step: si prepara il terreno di crescita con i supplementi

Supplementi: soluzione di vitamina, soluzione di L-treonina, soluzione di acido L-aspartico e aggiungere 300 μl di soluzione di solfato di Cu (II). Conservare la rimanente soluzione di solfato di Cu (II) per la preparazione del terreno di prova.


Nota:
il terreno di crescita deve essere usato entro 2 settimane se conservato a 4 °. Fino a 6 mesi se conservato a -20 °.

Prendere due flask (YES e YAS) per la coltura con tappo a filtro e aggiungere rispettivamente 5 ml di terrenno in ciascuna flask. Aggiungere un disco a filtro in ciascuna flask usando delle pinze sterili. Chiudere bene il tappo a filtro ventilato.
L’inizio della coltura dai dischi filtranti forniti può richiedere diversi giorni. Si raccomanda di iniziare le colture almeno una settimana prima della data prevista per il saggio.
Una volta ottenute le colture dense di entrambi i ceppi di lievito, possono essere diluiti 1:10 un giorno prima dell’inizio del test o conservati per diversi giorni a 4°C.
Riprenderanno la crescita una volta diluiti in terreno fresco e incubati a 31°C con agitazione.

Posizionare le boccette (non in posizione verticale!) in un agitatore orbitale e incubare le cellule del lievito a 31 ° C per 2-4 giorni.

Regolare la frequenza orbitale in modo che il liquido sia ben agitato ma non si rovesci nel collo delle flasks. Ciò garantisce un adeguato apporto di ossigeno per supportare una buona crescita delle cellule di lievito.

Giorno1:

1. Osservare la OD690
2. preparare le diluizioni del campione e del controllo direttamente in quattro piastre di diluizione da 96 pozzetti
3. diluire le cellule di lievito nel mezzo di prova e distribuirle nelle piastre a 96 pozzetti
4. sigillare le piastre con pellicola permeabile ai gas e assicurarsi che l’umidità sia preservata
5. incubare a 31 C per 18 ore in un agitatore orbitale con agitazione (100 giri/min).

 

 

Giorno 2

  1. mescolare i pozzetti e misurare OD 690 (valutare la citotossicità dei campioni
  2. trasferire 30 ml di cellule di lievito esposte a nuove piastre da 96 pozzetti
  3. aggiungere il substrato CPRG nel buffer di lisi con liticasi
  4. incubare a 31°C per 30-60 minuti
  5. misura OD 570 e OD 690
  6. valutare i risultati (con file Excel)