Nuovo test dei micronuclei – MOA TEST
MoA – Kit di nuova generazione
Rapid Micronucleus Centromere Telomere kit
MicroNucleus Test MNT In Vitro (OECD TG487) – Principio
Il test del micronucleo in vitro è uno dei saggi più diffusi e affidabili per l’individuazione di sostanze chimiche con potenziale genotossico. Le sostanze chimiche o gli agenti fisici possono generare cromosomi acentrici (evento clastogenico) oppure causare una segregazione impropria di cromosomi interi (evento aneugenico), portando a un danno genetico sotto forma di un nucleo erratico e di dimensioni ridotte, chiamato micronucleo.
È possibile progettare studi sia in vitro sia in vivo. I primi vengono generalmente eseguiti utilizzando linee cellulari di mammifero, tipicamente dopo la somministrazione delle sostanze in esame (sostanze chimiche o miscele). Il saggio del micronucleo in vivo viene effettuato su cellule del sangue periferico per studi di citogenetica e per indagini sugli effetti genotossici delle radiazioni e dell’irradiazione.
Le caratteristiche del micronucleo consentono di identificare il meccanismo d’azione quando si applicano le sonde FISH. Queste informazioni sono molto importanti per comprendere appieno i dettagli biologici dell’agente genotossico e per progettare studi successivi mirati ad approfondirli.
Il saggio del Micronucleo è descritto nella linea guida OECD TG487. In breve, le cellule di mammifero vengono coltivate in fase di crescita esponenziale durante il trattamento fino al momento del prelievo.
Le cellule devono trovarsi in diverse fasi del ciclo cellulare e devono completare almeno 1,5–2 cicli cellulari durante l’esposizione alla sostanza chimica in esame.
I protocolli di trattamento possono variare a seconda delle linee cellulari, delle colture cellulari primarie o dei linfociti.
La maggior parte degli aneugeni e dei clastogeni può essere rilevata durante un periodo di trattamento di 3–6 ore, in assenza o in presenza di attivazione metabolica tramite la frazione microsomiale epatica di ratto S9.
Dopo l’esposizione, il mezzo di coltura, l’S9 (se aggiunto) e il composto in esame vengono rimossi, viene aggiunto mezzo fresco e le cellule vengono incubate per un periodo pari a 1,5–2 cicli cellulari
Rapid Micronucleus MoA
TEST PER IL RILEVAMENTO DI MICRONUCLEI, CLASTOGENI, ANEUGENI, E ALTRE ABERRAZIONI CROMOSOMICHE COME NPB, NBUD – OECD TG487, OECD TG473– RISULTATI IN DUE ORE
Il Rapid Micronucleus MoA (Mode of Action) è un kit pronto all’uso per l’identificazione rapida della rottura cromosomica (effetto clastogenico) o del danneggiamento dell’apparato del fuso (effetto aneugenico) in cellule di mammifero in divisione (cellule primarie, quali i linfociti umani, o la linea cellulare TK6). Il kit è stato sviluppato per rilevare il potenziale genotossico di sostanze chimiche.
Il kit pronto all’uso Rapid Micronucleus MoA consente di rilevare aberrazioni quali micronuclei (MN), ponti nucleoplasmatici (NPB), gemme nucleari (NBUD), nonché eventi aneugenici e clastogenici, in conformità alle linee guida OECD TG 473 o OECD TG 487. È stato dimostrato che i ponti nucleoplasmatici e le gemme nucleari sono associati a instabilità cromosomica e ad aberrazioni cromosomiche.
Le cellule vengono preparate secondo i protocolli standard descritti nelle linee guida OECD TG 487 o TG 473 e i vetrini vengono successivamente trattati con una serie di soluzioni fornite con il kit Rapid Micronucleus MoA, comprendenti una sonda centromerica umana altamente sensibile e specifica e una soluzione di controcolorazione contenente DAPI (4’,6-diamidino-2-fenilindolo).
Dopo il trattamento, i vetrini vengono lavati sequenzialmente con PBS e con una serie di soluzioni di etanolo. Le sonde centromeriche vengono quindi applicate all’area di interesse e il vetrino viene riscaldato a 80 °C per 3 minuti, quindi trasferito in una camera umidificata per 20 minuti. Seguono ulteriori lavaggi e una fase di controcolorazione di 5 minuti, prima dell’aggiunta del mezzo di montaggio.
Utilizzando un obiettivo con ingrandimento 40×, è possibile identificare agevolmente i micronuclei e valutare la presenza del centromero. La lettura automatizzata e l’archiviazione dei dati possono essere ottenute mediante sistemi di scansione dei vetrini, quali ad esempio Metafer.
I vetrini risultano generalmente pronti per la valutazione entro 1 ora. L’applicazione delle sonde FISH consente di distinguere direttamente i micronuclei derivanti dalla perdita cromosomica (composti aneugenici) da quelli originati da rottura cromosomica (composti clastogenici).
La tecnologia delle sonde FISH, così come utilizzata nel kit Rapid Micronucleus MoA, può inoltre essere impiegata per analisi citogenetiche in ambito di ricerca o nella dosimetria fisica, ad esempio in soggetti esposti a radiazioni di origine medica o naturale
Caratteristiche del Nuovo MoA Kit di Seconda Generazione.
Saggio rapido (2–3 ore) per identificare il meccanismo d’azione tramite sonde centromeriche fluorescenti – Kit Telomero-Centromero
- Rapido: Saggio FISH di 2 ore con una risposta chiara alla modalità di azione
- Identificazione rapida di aneugeni e clastogeni con valore aggiunto telomerico
- Rilevazione di ponti nucleoplasmici (NPBs) e NBUDs
- Specificità molto elevata, nessun risultato falso positivo:
– Nessuna interferenza da parte dell’RNA
– Nessuna interferenza da parte di micronuclei a bassa densità
– Nessuna interferenza da parte dei precipitati
– Nessuna interferenza da alterazioni citoplasmatiche - L’attuale configurazione del kit consente il test di colture cellulari umane (ad esempio cellule TK6), sangue intero o linfociti
- Valutazione rapida delle aberrazioni cromosomiche nella dosimetria biologica
- Istruzioni per l’uso: migliorate significativamente le IFU per ottenere risultati ottimizzati
Cod. M020 – Kit per eseguire 20 test
Cod. M100 – Kit per eseguire 100 test